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    PCR 引物設計

    發布時間: 2023-05-05  點擊次數: 414次

    好的引物會讓 PCR 實驗成功一半,因而,引物設計一直都是 PCR 非常重要的環節。經典之法就是讓 Premier5 攜手 oligo,共同設計 PCR 引物。

    1、以小鼠的 IL-17 為例,進入 NCBI 界面,選擇 Nucleotide 后,輸入 IL-17,點擊 search。然后選擇人類 IL-17 的 mRNA,在 CDS 選項中,找到編碼區所在位置,在下面的 origin 中,
    選定目的序列。

    2、打開 Primer Premier5 軟件,點擊菜單欄 File|New|DNA Sequence,在出現的對話框里黏貼目的序列,并在 paste 對話框里選擇 As Is,點擊 OK。

    3、點擊 Primer,彈出菜單后點擊 search 按鈕。在彈出的 Search Criteria 中,選擇 PCR primers,Pairs 參數,并選擇所需PCR 產物長度,點擊 OK。在彈出的 search progress 菜單中,點擊 OK。

    4、在搜索出的結果列表里選擇 Rating 值高,bug 較少的引物#1,在 Primer Premier 中選擇 S(正義鏈)/A(反義鏈),點擊 edit primer,將所得引物改成為 Rating 值為 100,無 bug 的引物,即無發夾(Hairpin)、無二聚體(Dimer)、無錯配(False Priming)和交叉配對(Cross Dimer)的引物。點擊 Accept and Quit 命令即可。

    5、點擊菜單欄中 Edit∣Copy∣Sense Primer/Anti-sense Primer,即可得到設計的引物。

    6、接下來,就要用 Oligo 軟件驗證評估 Premier5 軟件所設計的引物,單擊菜單欄里 File∣New Sequence 可打開以下窗口,并將設計好的上游引物黏貼在空白框里。

    7、點擊菜單欄里 Accept/Discard 中的 Accept,則會出現 Tm、△G 和 Frq 三個窗口, △G 值反應了序列與模板的結合強度,最好引物的△G 值在 5’端和中間值比較高,而在 3’端相對較低。

    8、點擊菜單欄里的 Select 中的 Upper Primer 將當前引物設置為上游引物。同時點擊菜單欄里的 Edit 中的“Lower Primer"命令,在 Edit Lower 窗口中輸入下游引物的序列。點擊 Accept and Quit 命令即可。

    9、最后,在菜單欄中 Analyze 完成引物△G 值、Tm 值、引物二聚體和發夾結構的分析后,可將引物序列送至公司進行合成即可。


    深圳安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術實力、壹流的經營管理水平和完善的市場銷售體系的生物高科技企業??偛吭O在廣東,服務面向全國。安培生物集進口試劑、實驗室耗材銷售、技術服務與合約開發為一體的專業化高科技公司,旨在為生命科學的發展提供壹流的產品與服務。本公司建立了涵蓋分子生物學、細胞生物學、免疫學、信號傳導和神經科學等領域的產品供應線,在各個領域內向用戶提供世界前沿水平和質量穩定的產品,安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等優質客戶提供優質的產品、技術支持與服務。


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